從完整肌腱到單纖絲：偏振紅外光譜強勢助力膠原蛋白的分子取向研究

       在過去的十年里，紅外（IR）光譜已被廣泛應用于哺乳動物組織中的膠原蛋白研究。對有序膠原蛋白光譜的更好理解將有助于評估受損膠原蛋白和疤痕組織等疾病。因此，用偏振紅外光研究膠原蛋白（I型膠原和II型膠原）的層狀結構和徑向對稱性逐漸成為研究熱點。目前，基于焦平面陣列檢測器的偏振遠場（FF）傅立葉變換紅外（FTIR）成像、偏振遠場（FF）、光學光熱紅外（O-PTIR）以及散射型掃描近場光學顯微鏡（s-SNOM）的納米紅外技術在膠原蛋白域得到廣泛應用。偏振遠場（FF）方法可應用于完整肌腱的截面，其纖維平行且垂直于偏振光排列。光學光熱IR紅外（O-PTIR）和納米傅立葉變換紅外（nano-FTIR）方法則應用于直徑為100~500 nm的原纖維，在生物聚合物上共同實現互相印證和互補的結果。

       通常，I型膠原蛋白在偏振紅外光下反應不同。采用基于焦平面陣列（FPA）檢測的遠場傅里葉變換IR（FF-FTIR）對其進行成像時，受制于蛋白質酰胺I和II的紅外征峰吸收帶的波長（~7 μm）的分辨率限，難以獲取高質量的成像結果。而采用散射型掃描近場光學顯微鏡（s-SNOM）方法的納米FTIR（nano-FTIR）光譜技術，可以獲得空間分辨率約為20nm的紅外光譜，解決了受限于IR輻射波長的限制（通常5-10 μm）。此外，采用光學光熱紅外技術（O-PTIR）成像和光譜學的方法，也可以擺脫紅外波長的限制，實現亞微米（500nm）的空間分辨率，為完整組織和原纖維膠原蛋白的研究打開了個新窗口。

       近期，在Kathleen M. Gough等人的研究中^[1]，作者采用基于光學光熱紅外（O-PTIR）技術的PSC非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統 mIRage對樣品?500 nm單點區域收集振動光譜，如圖1所示。該光學光熱紅外（O-PTIR）技術的工作原理是光熱檢測，其中紅外量子聯激光器（QCL）激發樣品在1800–800 cm^-1光譜范圍內的分子振動。產生的光熱效應通過短波長探測激光器檢測。圖2A-B中的光譜表明，固有的激光偏振所獲得的高對比度所產生的光譜與使用FTIR焦平面陣列和偏振器組合進行的光譜測試近乎致。并且對于安裝在玻璃顯微鏡的不同載玻片，樣品均獲得了具有良好SNR的高質量光譜。

圖1. 完整肌腱的光學光熱IR（O-PTIR）光譜，?500 nm測量點。（A）用線性偏振量子聯激光器（QCL）從CaF₂窗口在平行和垂直兩個不同方向上獲得光譜。插入的可視圖像顯示了6個采譜位置；比例尺= 70 µm。（B）對比從CaF₂（頂部）和玻璃（底部）載玻片在線性偏振QCL的平行和垂直方向上獲得的光譜。

       光學光熱紅外（O-PTIR）技術可以通過在載物臺上輕易地旋轉樣品來測試平行和垂直于紅外激光偏振方向的光譜。并用光學光熱紅外（O-PTIR）技術在幾個單頻率下對原纖維成像，以獲得表觀物理寬度的確定性估計。如圖2右側所示，在垂直方向上， 1655 cm^-1處記錄的單波長圖像的紅黃帶表明該原纖維的寬度不超過500 nm。該尺寸將目標物標定為真正的原纖維，并且可與紅外s-SNOM實驗中檢測到的300 nm原纖維相當。光學光熱紅外（O-PTIR）技術與nano-FTIR的測試結果相互印證，反映了“原纖維”寬度的標準范圍。此外作者觀察到，來自原纖維的酰胺I和II譜帶比完整肌腱的窄，并且相對強度和譜帶形狀都發生了變化。這些光譜反映出在偏振紅外光下正常I型膠原纖維的更多有用信息，并可作為研究膠原組織的基準。

圖2. 從CaF₂窗口用O-PTIR測試控制肌腱原纖維獲得的光譜。用平行于激光偏振的原纖維獲得的頂光譜（紅色）；藍色是垂直方向上的光譜。右側是在垂直方向基于1655 cm^-1的單波長圖像。正方形表示光譜采集位置。比例尺= 1 µm。

       與基于焦平面陣列檢測器的偏振遠場傅立葉變換紅外（FF-FTIR）光譜相比，光學光熱紅外（O-PTIR）具有更高的空間分辨率，且可提供單波長光譜。使用FF-FTIR FPA探測往往包括其他非膠原材料。同時，光學光熱紅外（O-PTIR）還可以提供偏振平行于原纖維取向的原纖維光譜。這也是光學光熱紅外（O-PTIR）和納米FTIR光譜對直徑為100~500 nm的膠原原纖維給出證實性和互補性結果的*證明。綜上所述，這些結果為進步研究生物樣品中的膠原蛋白提供了廣闊的基礎。

參考文獻：

[1]. Gorkem Bakir, Benoit E. Girouard,  Richard Wiens, Stefan Mastel, Eoghan Dillon, Mustafa Kansiz, Kathleen M. Gough, Molecules 2020, 25, 4295; doi:10.3390/molecules25184295.