單分子追蹤助力Nature子刊！整合素相互作用蛋白的功能與作用機制研究

研究背景：

FERM結構域的蛋白家族中，黏著斑蛋白（kindlin）和踝蛋白（talin） 是進化上高度保守并且在FERM結構域中表現出高度同源性。kindlin家族在整合素（integrin）活化中發揮重要作用，參與integrin的雙向信號傳導，對整合素受體介導的細胞與細胞外基質的黏附、細胞-細胞外基質的黏附、細胞遷移、胚胎發育、損傷修復等過程中發揮關鍵作用。此外kindlin的異常還可以導致多種遺傳性疾病的發生，同時kindlin家族作為重要的信號分子還參與了腫瘤的發生發展過程。

近日，《Nature Communications》刊登了Grégory Giannone等學者的新研究成果，該團隊使用Abbelight 3D單分子超分辨成像系統SAFe 360的超分辨-單分子追蹤技術（SPT-PALM）研究了kindlin和talin等蛋白在細胞質膜中的擴散機制。

研究內容：

焦點黏著斑蛋白（FAs）家族廣泛參與整合素依賴型細胞粘附、性和遷移等過程，通過直接或間接的方式結合在細胞外基質（ECM）和肌動蛋白細胞骨架之間，并與具有不同結構、信號或支架功能的蛋白建立物理聯系。然而FAs蛋白如何被引導到定的納米層以促進與定靶點的相互機制目前尚不清楚。為探究其機制，Grégory Giannone等將kindlin的蛋白分子行為和3D納米定位與其在FAs內integrin激活中的功能聯系起來，通過單蛋白追蹤、超分辨成像以及功能分析kindlin在上膜的定位和擴散對integrin激活、細胞擴散和FAs形成過程，并通過研究發現kindlin通過與talin不同的途徑來達到和激活integrin，為integrin激活期間的互補性提供了可能的分子基礎。

，作者通過追蹤integrin在細胞中不同區域的單分子運動軌跡，計算單個β1-integrin或者β3-integrin分子的擴散系數，并比較integrin在FA內和FA外的擴散系數，發現integrin在FA中有自由擴散（綠色軌跡），被束縛的區域擴散（黃色軌跡）和固定不動三種不同模式。不同的細胞中，integrin在FA外普遍表現出更快的擴散速度，更多傾向于純自由擴散。同時Mn²⁺的處理會讓更多的integrin分子傾向于固定不動，也即參與同kindlin和或talin相互作用。經過計算kindlin突變體和talin突變體中β1-integrin或者β3-integrin的擴散系數并比較，發現對于這兩個突變體，Mn²⁺處理結果略有不同，kindlin突變體中integrin分子傾向于固定不動的比例相對于talin突變體較低些。

integrin，kindlin和talin在細胞中的擴散的軌跡分布于擴散系數分布

為了進步分析kindlin和talin與integrin相互作用的機制，觀測比較kindlin和talin單分子擴散軌跡可發現integrin和kindlin通過細胞膜自由擴散立進入焦點黏著斑（FAs），而talin和paxillin通過胞漿自由擴散到達FAs。在FAs中integrin展現自由擴散和被束縛的擴散兩種擴散模式，兩種模式都是通過kindlin和talin的結合觸發。自由擴散時integrin，kindlin和talin同時以正確的取向結合的概率非常低，Grégory Giannone等學者研究顯示三者更傾向于如上圖所示的模型，也即在質膜上自由擴散的integrin和kindlin會形成不可移動的integrin-kindlin復合物(i)；這種復合物可以限制整合素β端的方向，并有于talin與近端NPxY基序的結合，從而形成短暫integrin-kindlin-talin的三元復合物(ii)；kindlin可以間歇性地解離(iii)并再次(ii)與壽命更長的integrin-talin復合物重新結合。這種瞬態的integrin-kindlin-talin三元復合物的相互作用會大大延長integrin和talin的相互作用的持續時間。talin和kindlin脫附后integrin會繼續恢復自由擴散的模式，直至再次和kindlin結合。

kindlin和talin激活整合素的示意圖模型

實驗設備簡介：

本實驗中實用的單分子示蹤系統是abbelight公司研發的3D單分子定位顯微系統—SAFe 360，用其有的DAISY技術將xyz方向的定位精度提高至15 nm，可以精確觀測蛋白顆粒的定位分布及其運動軌跡。除此之外，該設備還具備大視場和鍵式操作，能夠大幅度降低單分子定位操作技術的門檻，幫助研究者從事分子機制的研究。

典型采集實例：

神經元超分辨成像	大腸桿菌	線粒體三維結構	外泌體成像

參考文獻：

[1] Orré, Thomas, et al. "Molecular motion and tridimensional nanoscale localization of kindlin control integrin activation in focal adhesions." Nature communications 12.1 (2021): 1-17.

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